淺談影響熒光定量PCR實驗結果的幾大因素

淺談影響熒光定量PCR實驗結果的幾大因素

首先什么是PCR呢？

PCR的全稱是聚合酶鏈式反應（英文全稱：Polymerase Chain Reaction），是一種體外酶促合成特異DN的方法，也可以稱作無細胞分子克隆或DNA序列體外引物定向酶促擴增技術。它不僅可用于基因分離，克隆和核酸序列分析等基礎研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方。

PCR分為定性PCR和定量PCR兩類：定性PCR只能通過終點法對擴增產物進行定性分析，而不能進行定量分析；定量PCR能通過加入的熒光分子信號的變化來實現對PCR產物的實時檢測。相對來說，定量PCR的檢測靈敏度更高；特異性好，準確性高；線性關系好，范圍寬；操作更簡單安全。

PCR實驗的基本因素及過程反應成分：引物，酶，模板DNA，dNTP，Mg2+鎂離子濃度 。

反應過程：1、模板變性；2、引物退火；3、新鏈延伸。

這三個步驟為一個循環，每一個循環度產物均可作為下一個循環度模板，經過n次循環后，目的DNA以2n的形式增加。

除了以上五個主要因素外，還有實驗耗材因素和溫度因素：

1：首先PCR實驗試劑的總體積一般為25ul~100ul，因此所選用的耗材必須是吸附低的；

2：PCR實驗需要高溫解鏈，低溫合鏈，中溫延伸，因此要求所選用的耗材需要有很好的熱傳導率；

3：PCR實驗需要不斷的循環升溫，降溫，這就要求所選用的耗材必須有良好的氣密性；

4：PCR實驗還需要循壞的收集數據，需要選用的耗材有良好的均一性。

5：另外根據實驗使用儀器的不同，熒光定量實驗中熒光讀取方式不同，對耗材還有以下不同的要求：

  a:采用頂部熒光照射并于頂部回收熒光的儀器，要求管蓋或者封板膜必須是光學透光的性能，同時管壁最好選擇不透光材質；

  b：采用側方熒光照射并于頂部回收熒光的儀器，要求管蓋或者封板膜必須是光學透光性，同時管壁也要是高透光的透明材質；

  c：采用側方熒光照射并于側方回收熒光的儀器，要求管蓋或者封板膜最好選用不透光材質，同時管壁選擇高透光的透明材質。